Zastosowanie reakcji derywatyzacji do opracowania nowych procedur oznaczania kwasu liponowego

Abstract

Kwas liponowy jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania organizmu człowieka. Niestety, ilość wytwarzana przez człowieka nie zawsze jest wystarczająca, dlatego kwas liponowy powinien być dostarczany do organizmu z zewnątrz. Pokarm jest drugim, oprócz syntezy de novo, źródłem tego związku. Niezwykle ważna jest informacja dotycząca zawartości omawianego związku w spożywanych produktach. W dostępnej literaturze nie znaleziono danych dotyczących badań polskich produktów spożywczych. W części literaturowej przedstawiono charakterystykę badanego związku, jego właściwości fizyczne oraz chemiczne. Oddzielny rozdział poświęcono omówieniu funkcji biologicznych, metabolizmowi oraz wykorzystaniu kwasu liponowego m.in. w medycynie i kosmetologii. Omówiono naturalne procesy syntezy i laboratoryjne sposoby otrzymywania badanego analitu oraz jego występowanie w produktach spożywczych. Szczególną uwagę zwrócono na metody wydzielania oraz techniki oznaczania kwasu liponowego w próbkach biologicznych, środkach spożywczych, a także w suplementach diety. Opisano również proces modyfikacji cząsteczki kwasu liponowego w celu uzyskania kompatybilności formy oznaczanej substancji ze stosowanym detektorem. Na podstawie przeprowadzonego przeglądu literatury stwierdzono, że nie ma jednej doskonałej metody oznaczania kwasu liponowego, dlatego też w niniejszej pracy podjęto próbę opracowania prostej metody oznaczania tego związku w próbkach produktów spożywczych oraz suplementach diety. Opracowana procedura składa się z następujących etapów: homogenizacji, ekstrakcji, derywatyzacji oraz końcowego oznaczenia. Ze względu na brak w budowie cząsteczki kwasu ugrupowań fluoroforowych i chromoforowych, kwas liponowy wymagał modyfikacji poprzez zastosowanie procesu derywatyzacji. Sprawdzono analityczną przydatność odczynników derywatyzujących takich jak: tetrafluoroboran 2-chloro-1-metylochinoliniowy (CMQT), jodek 2-chloro-1-metylopirydyniowy (CMPI), 2,4’-dibromoacetofenon (DBAF) oraz alkohol 4-metoksybenzylowy (4-MBA) nie wykorzystywanych do tej pory w analityce kwasu liponowego (LA). Do otrzymania zredukowanej formy kwasu liponowego zastosowano borowodorek sodu (NaBH4). Zarejestrowano widma 1H NMR, IR, MS oraz widma absorpcyjne analizowanych związków. Zoptymalizowano parametry poszczególnych etapów metod oznaczania. Dobrano najlepsze warunki tworzenia produktu reakcji derywatyzacji tj.: środowisko reakcji, czas i temperaturę prowadzenia procesu, ilość dodawanego odczynnika derywatyzującego. Otrzymane pochodne wykorzystano do opracowania nowych spektrofotometrycznych i chromatograficznych metod oznaczania kwasu liponowego. Określono zakresy liniowości, współczynniki determinacji, powtarzalność, granicę oznaczalności oraz wykrywalności poszczególnych metod. Praktyczną użyteczność opracowanych metod sprawdzono oznaczając zawartość kwasu liponowego w próbkach spożywczych oraz suplementach diety w oparciu o techniki spektrofotometryczne i chromatograficzne z detekcją UV (HPLC-UV) oraz GC-MS.

Lipoic acid is necessary to obtain a full human connection. Unfortunately, the amount produced by man is not always sufficient, which is why lipoic acid should be supplied to the mechanism from the outside. Food is the second, in addition to de novo synthesis, source of this compound. The information included in the content of the compound in question in consumed products is extremely important. No data on the research of Polish food products were found in the available literature. The literature part presents the characteristics of the tested compound, its physical and chemical properties. A separate chapter is devoted to discussing biological functions, metabolism and the use of lipoic acid, including in medicine and cosmetology. Natural synthesis processes are discussed and laboratory methods for obtaining the analyte and its occurrence in food products. Particular attention was paid to the methods of secretion and techniques for determining lipoic acid in biological samples, foodstuffs, as well as in dietary supplements. The process of modifying the lipoic acid molecule to make the form of the substance to be tested compatible with the detector was also described. Based on the review of the literature, it was found that there is no one perfect method for determining lipoic acid, therefore in this PhD thesis an attempt was made to develop a simple method for determining this compound in samples of food products and dietary supplements. The developed procedure consists from the following stages: homogenization, extraction, derivatization and final assay. Due to the absence of an acid molecule in the fluorophore and chromophore moieties, the lipoic acid required modification through the derivatization process. The analytical suitability of derivatizing reagents such as 2-chloro-1-methylquinolinium tetrafluoroborate (CMQT), 2-chloro-1-methylpyridinium iodide (CMPI), 2,4′-dibromoacetophenone (DBAF) and 4-methoxybenzyl alcohol (4-MBA) not yet used in lipoic acid (LA) analytics. Sodium borohydride (NaBH4) was used to obtain the reduced form of lipoic acid. 1H NMR, IR, MS and absorption spectra of the analyzed compounds were recorded. The parameters of individual stages of the determination methods have been optimized. The best conditions for creating a derivatization reaction product were selected, i.e. environment reaction, time and temperature of the process, amount of derivatizing reagent added. The obtained derivatives were used to develop new spectrophotometric and chromatographic methods for determining lipoic acid. The range of linearity, determination coefficients, repeatability, limit of quantification and detectability of individual methods were determined. The practical usability of the developed methods were checked by determining the content of lipoic acid in food samples and dietary supplements based on spectrophotometric and chromatographic techniques with UV detection (HPLC-UV) and GC-MS.