Rozwój i zastosowanie analityczne bioczujników z detekcją powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji imaging (SPRI)

Abstract

Badania przedstawione w niniejszej pracy doktorskiej dotyczą procesu konstrukcji nowych bioczujników SPRI i opracowania nowych, bezznacznikowych oraz szybkich metod analitycznych do pomiaru stężenia wybranych biomolekuł w różnych rodzajach próbek. Opracowano siedem metod analitycznych określania stężenia diagnostycznie użytecznych biomolekuł opartych na nowo-skonstruowanych bioczujnikach SPRI. Były to bioczujniki do oznaczania wybranych elementów szlaku ubikwityna-proteasom (immunoproteasom C-terminalna hydrolaza ubikwityny-UCH-L1) oraz do wykrywania niektórych substancji macierzy pozakomórkowej (laminina-5, kolagen IV i fibronektyna). Opracowano szczegóły budowy podstawy bioczujników, tak aby dała możliwość badania jak największej liczby próbek w tym samym czasie. Stosowano różne sposoby immobilizacji receptora (tworzenie wiązań kowalencyjnych oraz oddziaływania hydrofobowe). W zależności od strategii immobilizacji do zmodyfikowania powierzchni złota na chipie wykorzystano różne rodzaje tiolów. Jako bio-rozpoznający element bioczujnika wykorzystano przeciwciała oraz naturalne i syntetyczne inhibitory. Opracowano metodę regeneracji bioczujników do monowarstwy tiolowej Wszystkie opracowane metody poddano obszernej charakterystyce analitycznej obejmującej wyznaczenie selektywności, zakresu liniowej odpowiedzi, precyzji i odzysku, a także oznaczanie w próbkach naturalnych połączone z walidacją przez równoległe oznaczanie metodą uznawaną za standardową (ELISA).

The research presented in this thesis concerns construction process of new SPRI biosensors and developing new, non-labeled and fast analytical methods for measuring the concentration of selected biomolecules in various types of samples. In general, seven analytical procedures for the diagnosis of useful molecules were developed using newly developed biosensors. Biosensors for determination of selected elements of ubiquitin-proteasome pathway (immunoproteasom, ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1-UCH-L1) and for detecting some substances of extracellular matrix (laminin-5, collagen IV and fibronectin) were developed. Different immobilization methods of receptor were applied (covalent bonds, hydrophobic interaction). Depending on the strategy of immobilization, the various types of thiol to modify the gold on the chip were used. Antibodies, natural and/or synthetic inhibitors as a bio-recognition element of biosensor were used. The method for regenerationof biosensors to thiol monolayer was development. All developed methods were submited to extensive analytical characteristics. The selectivity, linear response range, precision and recovery was determination. In order to validate the developed method, the comparative determination of biomolecules in the same natural samples by the commercial ELISA kit was performed.