Badania użyteczności potencjalnych biomarkerów w diagnostyce choroby Alzheimera z wykorzystaniem biosensorów SPRi

Abstract

Niniejsza rozprawa doktorska skupia się na wykorzystaniu nowych metodanalitycznych opartych na matrycowych biosensorach SPRi w ocenie stężenia wybranych markerów takich jak: proteasom 20S, C-końcowa hydrolaza ubikwityny (UCH-L1),fibronektyna (FN), metaloproteinaza 1 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP1), cystatynaC (cysC), leptyna (LEPT), neuropilina-1 (NRP1) oraz białko fosfo-tau181, w odniesieniu do możliwości diagnostycznych w chorobie Alzheimera. W ramach badań eksperymentalnych wchodzących w zakres rozprawy wchodzi również konstrukcja immuno-sensora czułego na białko fosfotau 181 i walidacja nowej metody analitycznej opartej na tym biosensorze. Wykazano skuteczność biosensora w odniesieniu do próbek krwi pacjentów z chorobą Alzheimera.Oznaczanie wybranych markerów prowadzono w 110 próbkach surowicy krwi od chorych ze zdiagnozowaną chorobą Alzheimera jak również na grupie kontrolnej (60 próbek), którą stanowiły osoby w podobnym wieku do grupy badanej ale bez upośledzonych funkcji poznawczych. Badania pozwoliły ocenić, że pacjenci z AD charakteryzują się wyższą medianą białka UCHL1 (56,05 vs. 7,98 ng/ml, p < 0,000001)niż zdrowe jednostki. U pacjentów z AD również stężenie proteasomu 20S było wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (13,02 vs. 5,72µg/ml, p < 0,0001). Stwierdzono istotną dodatnią korelację pomiędzy stężeniem UCHL1, a stężeniem proteasomu w grupie AD, a ujemną w grupie kontrolnej. Analiza stężenia fibronektyny w surowicy u chorych na AD wykazała istotnie wyższą medianę stężenia w porównaniu z grupą kontrolną (652,06 vs.268,31 µg/ml). Ponadto wykazano, że pacjenci z AD charakteryzują się istotnie niższą medianą MMP-1 (4,62 vs. 18,09 ng/ml). Zaobserwowano także, że pacjenci zaklasyfikowani do kategorii 3i 4 na podstawie testu MMSE różnili się stężeniem MMP-1. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy wynikiem uzyskanym w teście MMSE a stężeniem MMP-1. Istnieje dodatnia korelacja między stężeniem fibronektyny, a wiekiem w grupie kontrolnej.Zawartość leptyny istotnie wzrasta u chorych na AD w porównaniu do osób zdrowych(9,97 vs. 3,08ng/ml,p < 0,00001). Ponadto u pacjentów z AD stwierdzono istotnie wyższy poziom cystatynyC(1,53 vs. 0,56µg/ml, p < 0,00001). Wzrasta także poziom białka fosfo-tau181 (8,46 vs.4,19pg/ml, p < 0,00001). U pacjentów z tą chorobą neurodegeneracyjną obserwuje się istotne obniżenie poziomu neuropiliny-1 (69,94 vs. 167,28ng/ml, p < 0,00001) i to jest zagadkowe w porównaniu do danych literaturowych. W pracy oceniono także korelację pomiędzy badanymi markerami oraz wartość diagnostyczną. Wykreślono krzywe ROC oraz wskazano punkty odcięcia dla wartości dla tych markerów, dla których zakresy u osób zdrowych „nie pokrywały się” z zakresami u osób chorych.Badania realizowane w ramach rozprawy doktorskiej pozwoliły na stwierdzenie dużego potencjału zastosowania matrycowych biosensorów z detekcją Powierzchniowego Rezonansu Plazmonów w wersji Imaging do badań w diagnostyce choroby Alzheimera.

This doctoral dissertation focuses on the use of new analytical methods based on SPRi matrix biosensors in the assessment of the concentration of selected markers such as20S proteasome, C-terminal ubiquitin hydrolase (UCH-L1), fibronectin (FN), extracellular matrix metalloproteinase 1 ( MMP1), cystatin C (cysC), leptin (LEPT), neuropilin-1(NRP1) and phospho-tau181 protein, about diagnostic possibilities in Alzheimer&#39;s disease. The experimental research in the dissertation&#39;s scope also includes the construction of animmunosensor sensitive to the phospho-tau 181 protein and the validation of a new analytical method based on this biosensor.The effectiveness of the biosensor has been demonstrated about blood samples of patients with Alzheimer disease. Selected markers were determined in 110 blood serum samples from patients diagnosed with Alzheimer disease and in the control group (60samples), which consisted of people of a similar age to the study group but without impaired cognitive functions. The studies assessed that AD patients are characterized by a higher median UCHL1 protein (56.05 vs. 7.98 ng/ml, p &lt; 0.000001) than healthy individuals. In patients with AD, the concentration of proteasomes was also higher compared to the control group (13.02 vs. 5.72µg/ml, p &lt; 0.0001). A significant positive correlation was found between the UCHL1 concentration and the proteasome concentration in the AD group and a negative correlation in the control group. Analysis of serum fibronectin concentration in AD patients showed a significantly higher median concentration than the control group(652.06 vs. 268.31 µg/ml). Moreover, it was demonstrated that AD patients have a significantly lower median MMP-1 (4.62 vs. 18.09 ng/ml). It was also observed that patients classified into categories 3 and 4 based on the MMSE test differed in MMP-1concentration. A positive correlation was found between the MMSE test result and MMP-1 concentration. There is a positive correlation between fibronectin concentration and age in the control group. Leptin content increases significantly in AD patients compared to healthy people (9.97 vs. 3.08ng/ml, p &lt; 0.00001). Moreover, substantially higher cystatinC levels were found in AD patients (1.53 vs. 0.56µg/ml, p &lt; 0.00001). The level ofphospho-tau181 protein also increases (8.46 vs. 4.19pg/ml, p &lt; 0.00001). In patients with this neurodegenerative disease, a significant reduction in the level of neuropilin-1 isobserved (69.94 vs. 167.28ng/ml, p &lt; 0.00001), which is puzzling compared to the literature data. The study also assessed the correlation between the tested markers and the diagnostic value. ROC curves were plotted, and cut-off points were indicated for the values of those markers for which the ranges in healthy people with those insick people.Research carried out as part of the doctoral dissertation allowed for identifying ahigh potential for using matrix biosensors with detection of Surface Plasmon Resonance inthe Imaging version for research in the diagnosis of Alzheimer disease.