Charakterystyka biochemiczna i strukturalna hydrolaz S-adenozylo-L-homocysteiny pochodzących z wybranych mikroorganizmów

Abstract

Przedstawione osiągnięcie naukowe stanowiące podstawę do nadania stopnia doktora dotyczy badań biochemicznych i strukturalnych bakteryjnych hydrolaz S-adenozylo-L-homocysteiny (SAHazy) pochodzących z Thermotogamaritima, Pseudomonasaeruginosa i Cytophagahutchinsonii. SAHazy regulują kluczowe dla metabolizmu komórki reakcje metylacji zależne od S-adenozylo-L-metioniny (SAM), poprzez kontrolę stężenia S-adenozylo-L-homocysteiny (SAH), silnego inhibitora szeregu procesów metylacyjnych.Enzymy te są najczęściej aktywne w formie homotetrameru, w którym każda z podjednostek: (i) ma budowę trójdomenową oraz (ii) wiąże po jednej cząsteczce substratu i kofaktoranikotynoamidowoadeninowego w formie utlenionej (NAD+). Obecność kofaktora jest konieczna do przeprowadzenia reakcji enzymatycznej. W trakcie cyklu katalitycznego, każda z podjednostek oscyluje pomiędzy dwiema konformacjami – otwartą i zamkniętą, co wynika z ruchu dwóch głównych domen w trakcie wiązania substratu i uwalniania produktu. Prezentowane przeze mnie badania miały na celu poszerzenie wiedzy dotyczącej tej grupy enzymów. Interdyscyplinarność badań opisanych w niniejszym osiągnięciu naukowym pozwoliła mi na rozwiązanie wielu problemów pojawiających się w trakcie realizacji poszczególnych etapów badawczych, a co za tym idzie, pozwoliło na osiągnięcie założonych celów. W trakcie prowadzenia badań nad hipertermofilnąSAHazą z T.maritima wykazałam, że rekombinowane białko uzyskane w temperaturze pokojowej nie wykazuje aktywności katalitycznej. Analiza modelu krystalograficznego wskazywała, że poszczególne podjednostki przyjmują dwie nietypowe konformacje, wykluczające aktywność enzymatyczną tak zwiniętego białka. Dodatkowo, tylko dwie z czterech podjednostek wiążą kofaktor, który ponadto występuje głównie w formie zredukowanej (NADH), co również uniemożliwia katalityczny rozkład SAH. W oparciu o opracowaną przeze mnie procedurę pomiaru aktywności enzymatycznej tej SAHazy wykazałam, że białko zyskuje pełną aktywność katalityczną w wysokiej temperaturze, jedynie w obecności utlenionej formy kofaktora. W oparciu o porównanie modeli krystalograficznych SAHazy z T. maritima w formie nieaktywnej i aktywnej wyjaśniłam podłoże molekularne procesu termoaktywacji tego białka, polegające na przestrzennej rearanżacji poprawnie ufałdowanych domen. W ramach badań związanych z SAHaząz P. aeruginosa zwróciłam uwagę na to, że aktywność katalityczna tego enzymu mocno zależy od typu jonu metalu alkalicznego obecnego w mieszaninie reakcyjnej. Wykazałam, że enzym osiągał najwyższą aktywność w obecności kationów K+ poprzez odpowiedni wpływ na dynamikę białka. Ponadto wykazałam, że wiązanie innych kationów wpływających na dynamikę tego białka może również prowadzić do inhibicji aktywności katalitycznej SAHazy. Zaobserwowałam to dla kationów Rb+ i Zn2+, które hamują aktywność enzymatyczną w sposób niekompetycyjny. W ramach badań scharakteryzowałam biochemicznie i krystalograficznie SAHazę z C. hutchinsonii. Badania strukturalne oparte o metody biokrystalografii dotyczyły enzymu w konformacji zamkniętej w kompleksie z kofaktorem w formie utlenionej (NAD+), adenozyną (produkt reakcji rozkładu SAH) oraz kationem Na+ związanym w pobliżu kieszeni wiążącej substrat. Dodatkowo, przeanalizowałam sposób upakowania cząsteczek białka w sieci krystalicznej, zwracając uwagę na interesujący przypadek generowania homotetramerów odpowiadających aktywnej formie enzymu w oparciu o kombinację elementów symetrii krystalograficznej oraz translacyjnej symetrii niekrystalograficznej. Podsumowując, uzyskane rezultaty stanowią nowe odkrycia i pozwalają na szersze zrozumienie aspektów biochemicznych i strukturalnych hydrolazy S-adenozylo-L-homocysteiny, dotyczących zwłaszcza nieznanych mechanizmów regulacji aktywności katalitycznej tej grupy enzymów.

The scientific achievement, described therein, which constitutes the basis for being conferred a doctoral degree, concerns the biochemical and structural characterization of S-adenosyl-L-homocysteine hydrolases (SAHases) from various bacteria, such as Thermotogamaritima, Pseudomonas aeruginosa and Cytophagahutchinsonii. SAHase is an essential element of cell metabolism, involved in the regulation of methylation reactions that utilize S-adenosyl-L-methionine (SAM) as a methyl group donor. SAM-Dependent methylation generates equimolar amounts of S-adenosyl-L-homocysteine (SAH), a potentinhibitorof SAM-dependent methylation processes. Therefore, cellular concentration of SAH has to be strictly controlled, and this function is fulfilled by SAHase. The enzyme is usually active as a homotetramer with a subunit folded into three domains. Each subunit binds one substrate and one nicotinamide adenine dinucleotide cofactor in its oxidized state (NAD+). A presence of the cofactor is required for the enzyme activity. Two principal domains, involved in substrate and cofactor binding, are connected by a two-part hinge element and the enzyme oscillates between two conformational states: open (ligand-free) and closed (with ligand bound) during the catalytic cycle.The studies presented hereinwere performed to broaden abiochemical and structural knowledge about SAHases. The interdisciplinary nature of the research were of key importance for the success of the research. In the course of research onhyperthermophilicSAHase from T. maritima, I revealed that a recombinant protein expressed and purified at room temperature is not active. A closer inspection of a crystallographic model of the protein showed, that individual subunits adopt two distinct and atypical conformations, which do not permit a protein folded in such manner to be enzymatically active. In addition, only two of the four subunits bind the cofactor, however, mainly in its reduced form (NADH). This fact alsoprecludes the enzymatic degradation of SAH. I have developed a new assay that indicated that the protein could gain a full catalytic activity only at a high temperaturein the presence of the oxidized form of the cofactor (NAD+). Based on crystallographic models of both, active and inactive forms of SAHase from T. maritima, I elucidated a mechanism of thermoactivation of the enyzme that is based on a spatial rearrangement of properly folded domains. While conducting research related to SAHase from P. aeruginosa, I noticed that the catalytic activity of the enzyme varies considerably, depending on the alkali metal ion present in the reaction mixture. Among tested cations, the K+ ion stimulates the highest enzymatic activity. An explanation of this phenomenon is that K+, but not other alkali cations, enables unique dynamic properties of the enzyme to ensure its maximum catalytic activity.The enzymatic activity can be influenced via regulation of protein dynamics, which depends on the type of coordinated cation. This mechanism can also be exploited for noncompetitive inhibition of the enzyme, as I observed for reactions performed in a presence of Rb+ and Zn2+ cations. The interdisciplinary research was also aimed at biochemical and structural characterization of SAHase from C.hutchinsonii. Within the study, I presented the crystal structure of recombinant enzyme in a ternary complex with NAD+, a reaction product/substrate (adenosine). Additionally, a sodium cation was identified in close proximity of the active site. The crystal contains two translational NCS-related dimers in the asymmetric unit. Two complete tetrameric enzyme molecules are generated from these dimers within the crystal lattice through the operation of two separate crystallographic twofold axes. To summarize, the results obtained are new discoveries, which allow a deeper understanding of numerous biochemical and structural aspects of S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, especially these related to previously unknown regulation mechanisms of the enzyme activity.