Rozwój metod oznaczania wybranych proteaz oraz inhibitorów proteaz z wykorzystaniem biosensorów SPRI

Abstract

Głównym celem badań było opracowanie nowych, bezznacznikowych, metod analitycznych umożliwiających pomiar stężenia wybranych proteaz w próbkach naturalnych, które mogą być wykorzystywane jako metody konkurencyjne do testów ELISA. Skonstruowano trzy nowe biosensory z detekcją metodą SPRI do oznaczeń ilościowych proteaz: MMP-1, MMP-2, katepsyny L. Przy konstrukcji poszczególnych biosensorów monitorowano tworzenie się kolejnych warstw związków na powierzchni poprzez badania z użyciem mikroskopu sił atomowych- AFM (dla MMP-1 i MMP-2) lub skaningowego mikroskopu elektronowego- SEM (dla katepsyny L). Bardzo ważnym elementem w procesie walidacji nowo opracowanych metod było porównanie stężeń każdego z enzymów oznaczonych, w różnego rodzaju próbkach naturalnych, za pomocą biosensorów SPRI z wynikami otrzymanymi przy użyciu testów ELISA. Porównanie potwierdziło dobrą korelację wyników z obu metod co stwarza możliwość wykorzystania tych biosensorów w diagnostyce laboratoryjnej jako metodę konkurencyjną w stosunku do testów immunoenzymatycznych. W pracy przedstawiono również pomiary aktywności enzymatycznej katepsyny L. W celu potwierdzenia użyteczności diagnostycznej biosensorów SPRI czułych na proteazy: katepsyny B, D i oraz cystatynę C przeprowadzono szereg pomiarów stężenia tych enzymów w różnych próbkach naturalnych. Otrzymane wyniki tych badań potwierdziły możliwość zastosowania pomiarów stężenia tych enzymów w kontroli przebiegu choroby oraz monitoringu chorego po przebytych procesach zapalnych, zabiegach, urazach.

The main aim of the research was to develop new, non-labeled, analytical methods to measure the concentration of selected proteases in natural samples that can be used as competitive methods for ELISA tests. Three new biosensors were created with SPRI detection for the quantification of proteases: MMP-1, MMP-2, cathepsin L. In the construction of individual biosensors, the formation of subsequent layers of compounds on the surface was monitored by AFM studies (for MMP-1 and MMP-2) or scanning electron microscopy - SEM (for Cathepsin L). A very important element in the validation of newly developed methods was the comparison of concentrations of each of the enzymes determined in various types of natural samples by using SPRI biosensors with the results obtained by using ELISA tests. The comparison confirmed a good correlation of results from both methods, which makes it possible to use these biosensors in laboratory diagnostics as a competitive method in relation to immunoenzymatic tests. The work also presents measurements of cathepsin L enzymatic activity. In order to confirm the diagnostic usefulness of SPRI biosensors sensitive to proteases: cathepsins B, D i and cystatin C, a series of measurements of the concentration of these enzymes in various natural samples were carried out. The obtained results of these studies confirmed the possibility of using measurements of these enzymes in the control of the disease and monitoring the patient after the inflammatory processes, treatments and injuries.