Opracowanie i charakterystyka elektrochemicznych genoczujników przeznaczonych do wykrywania wirusa ptasiej grypy typu H5N1

Abstract

Przedmiotem niniejszej rozprawy było opracowanie czułych elektrochemicznych genoczujników i zastosowanie ich do selektywnego wykrywania specyficznych sekwencji DNA i/lub RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1. Opracowano trzy bioczujniki z zastosowaniem złotych elektrod roboczych. Każdy z nich różnił się sposobem przyłączenia sondy DNA do powierzchni elektrody. Do obserwacji procesów hybrydyzacji zastosowano techniki elektrochemiczne: woltamperometrię cykliczną, woltamperometrię fali prostokątnej oraz elektrochemiczną spektroskopię impendancyjną w trójelektrodowym układzie pomiarowym. Jako analitów użyto 20-merowych sekwencji DNA, ok. 180-pz sekwencji DNA, a także 280-merowych sekwencji RNA. Długie testowane anality posiadały 20-merowe sekwencje komplementarne znajdujące się w różnych położeniach (na końcu 3', na końcu 5' lub na środku). Podjęto również próbę miniaturyzacji jednego z zaproponowanych genoczujników z zastosowaniem elektrod sitodrukowanych z pracującą elektrodą złotą. Za jego pomocą wykrywano m.in. niewymagające odwrotnej transkrypcji sekwencje RNA, co może stanowić podstawę do aplikacji w warunkach poza laboratoryjnych. Biorąc pod uwagę czułość i selektywność trzech przedstawionych genoczujników, można stwierdzić, że każdy z nich z powodzeniem nadaję się do wykrywania materiału genetycznego wirusa ptasiej grypy typu H5N1. Opracowane genoczujniki umożliwiały nie tylko wykrywanie 20-merowych fragmentów komplementarnych do sondy ssDNA znajdujących się w długich łańcuchach DNA i/lub RNA, ale także rozróżnienie ich położenia w analizowanych długich oligonukleotydach.

The subject of this dissertation was to develop sensitive electrochemical genosensors and their application for the selective detection of specific DNA and/or RNA sequences derived from the avian influenza virus subtype H5N1. Three DNA biosensors were developed using gold electrodes. The proposed sensors differed in the method of DNA probe attachment to the gold electrode surface. For observation of the hybridization processes electrochemical techniques was apllied: cyclic voltammetry, square wave voltametry and electrochemical impendance spectroscopy in a three-electrode configuration. 20-mer DNA sequence, ca. 180-bp DNA, and ca. 280-mer RNA sequences were used as analytes. The long testing analytes possessed 20-mer complementary sequences in the different positions (at the 3'-end, 5'-end or in the middle). One of the presented genosensor has been miniaturized screen printes electrodes. It was able to detect for example 280-mer RNA sequences, which do not require reverse transcription. It could provide a basis for the application in the field. Taking into account the sensitivity and selectivity, three genosensors demonstrated, were suitable to detect genetic material of avian influenza virus H5N1 subtype. A significant advantage of the genosensors proposed was ability to detect 20-mer fragments complementary to the probe ssDNA located in a 180-bp DNA or a 280-mer RNA. The developed genosensors also are able to distinguish the position of complementary sequences located in the long analysed oligonucleotides.